植物组织蛋白质提取方法汇总

R$l,m!F`(A.O#S0植物组织蛋白质提取方法 （一）712100社区5rF~m1Z{GH
1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。712100社区%f#ESUcb
2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。712100社区)DWPrOF#S:v
3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃712100社区9~!Taj0C
蛋白质提取液：300ml
`.Q,Qu2{l#hmh04、提取上清夜，样品制备完成。712100社区"eC)Q5~PW
1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml712100社区]sh3t7|
2、甘油（Glycerol）75ml712100社区-M3b1u:T:EA#P+f9T
3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g
"d0A6Gh/~4RLP~w0这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！
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3]"heU0Ve;L+_0植物组织蛋白质提取方法（二）712100社区QV
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三氯醋酸—丙酮沉淀法
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} C$R01、在液氮中研磨叶片
1[ S3J `n6|02、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。
T w)[%oU-HW/hY03、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。712100社区%]vD,X5E
4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
4f5wE$s9G&?6nc/a8v8Y%J05、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。712100社区
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药品：712100社区dzh$b7WEv
提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮712100社区
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裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。712100社区^+w-[\Tqx/`
这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！712100社区i+DKQ7~]-HT7a4l

TCA-丙酮沉淀法，有人做过落叶松的的花粉712100社区#SH$?bt#AB`8L)mV
步骤：712100社区&g[QF/Yl
1、液氮研磨充分712100社区 @1Pk2J(n t _/A
2、加入含10%TCA、0.07%的巯基乙醇的丙酮溶液，-20度沉淀过夜712100社区#ZF*u0Sl%z/{qK~
3、4度，1000rpm离心1个小时，弃上清。
N+P!k"c(Q2Q V04、加100%丙酮，含0.07%的巯基乙醇，沉淀一小时
cVy#\R"M9X05、4度，1000rpm离心15分钟，弃上清
;j'elC5QOdJ]06、重复第4、5步
3N~n'~]SA:`G07、80%丙酮，含0.07%的巯基乙醇，沉淀一小时712100社区0a;ynks:fq
8、重复第5步
:S4u?7?2R5ZyJ(y4e09、沉淀干燥。712100社区}pLV2@;IF6t8k8X

}Ha[0`(\Z0问题:712100社区I&jy]tp
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3XT.?(L tC6e^&PR01我最近在提植物的蛋白，做trince sds-page电泳，可是我查阅了相关资料，提取缓冲液有的是用最终浓度为200毫摩每升的tris-cl ，有的是用62。5毫摩每升的tris-cl，我不知道这种浓度究竟会对提蛋白有什么影响，另外，提蛋白质选用tris-cl的ph值又是怎么影响提取效果，也就是提植蛋白时究竟有哪些因素会影响到其效果的。
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z\*[t%l\+C+O0用200毫摩每升的tris-cl 和62.5毫摩每升的tris-cl,我们研究室一般用１００毫摩每升的tris-cl，pH 8.0 ．另外，最好加１５０毫摩每升的ＮaCl，用来分离以弱电荷结合到多糖上的蛋白。
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2我提的蛋白难溶，请问怎么解决？1、请问这是为什么呢？怎么解决？
-Y)k-[n*X{+X02、溶解时是先在100℃沸水浴后在涡旋吗？
.i-n'~ AEej#Ju0{03、涡旋时产生大量泡沫，对蛋白有影响吗？712100社区P&@Va4k^:]
4、是在常温溶解还是在4℃？或-20℃？
xwiEBA05、一般溶解需要多长时间？怎样才算溶解充分了？712100社区a
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我也是做植物叶片的，建议你可以用TCA-丙酮沉淀，方法如下：712100社区S&i~+G3[@HqI
1、在液氮中研磨叶片30min，加PVP，和石英砂
9r ||-c_:`O02、加入样品体积3倍的提取液(丙酮溶液1)在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃10000rpm以上1小时）弃上清。
-dnF0{QC03. 每份加入9ml丙酮溶液II，捣碎沉淀，常温振动混匀，-20℃沉淀1h；10000rpm，4℃离心15min，弃上清.
8nkO1]4`2H[a04. 每份加入9ml丙酮溶液II，常温振动混匀，-20℃沉淀1h；10000rpm，4℃离心15min，弃上清.712100社区Q+t w"E+Xn$S%f
5. 每份加入9ml 80%丙酮溶液III, 常温振动混匀，-20℃沉淀1h, 10000rpm，4℃离心15min，弃上清712100社区&P']tp:s4Q,W
6．干燥成硬块，磨成粉磨-20℃保存待用。
i]]D wbTM([ D0第二个问题：
B4IJS{037度水浴712100社区ro.f/e)X#WA
第三个问题：712100社区py9AA/~
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涡旋时产生大量泡沫，没有影响712100社区sj
xm,H}q6F p
第四个问题：712100社区zqB|I
37度溶解
/s.Y&RgQ0L0第五个问题712100社区r?0oA3Y/[g
1个小时，中间混匀数次

出现这种情况是很正常的，要是全部都溶了倒是不太正常。用沉淀法浓缩蛋白都存在一个变性的问题，在具体的操作过程中，有一部分蛋白变性了，所以会不溶解。操作的时候尽量保持低温！712100社区Rm$U(og:v6X9b5F8|e
溶解的时候可以在常温下，蛋白变成粉末后，立即加1*SDS上样缓冲液，用加样器吹打，大约5分钟就好，可以用来进行下一步的实验了。也可以在4度溶解过夜。712100社区8Bf5lf+R2v1k
涡旋时产生大量泡沫，个人认为影响不大
'OA!x&HG'MP0一般溶解半个小时就很充分了，但仍会有很多不溶物！可以离心弃掉！ 丙酮沉淀之后要干燥，这个过程一定不要时间太长，不然样品干燥得过了，就很难溶了。即使你加上了硫脲，高浓度尿素也不行。我的经验是只要半个小时左右就足够了，表面上看上去比较干就可以了。
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