植物组织蛋白质提取方法汇总
上一篇 / 下一篇 2008-07-31 13:19:13 / 个人分类:蛋白电泳
7PC"T\0tA
dKpa,d0植物组织蛋白质提取方法 (一)
!FVG%I-U{7R{&pz01、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液,可根据材料不同适当加入),准备提取液放在冰上。712100社区s eS"ZpXI7p.p
2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4小时)。712100社区.lR u/aQ ?!]7[
3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
y"}YZ9MX
gc!X0蛋白质提取液:300ml712100社区HZ1lc3p'\L
4、提取上清夜,样品制备完成。712100社区/Z3@5}RC!^^[
1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml712100社区B
_Y._7FFV
2、甘油(Glycerol)75ml
S1B
B0sJ$xvl03、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g
~T)AS,z/h5i7kz0这种方法针对SDS-PAGE,垂直板电泳!
Y;L6W2R~_ el` {0712100社区*Y(p"\)BZX-o
植物组织蛋白质提取方法(二)712100社区
QS[UU+|'e
三氯醋酸—丙酮沉淀法712100社区*\j4?j+J5E^Q
1、在液氮中研磨叶片
%j+L}3y#q$Bby:u$L8A02、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。
vm2mE9c03、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时),然后真空干燥沉淀,备用。
7Yv/RH0j&oz`04、上样前加入裂解液,室温放置30分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4℃待用。
t0azp?v#k05、用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用。712100社区 yRqNS0U*@DxP
药品:712100社区]o&f]d~y
提取液:含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮
P1oE&@1R2f Q[0裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入1M的DTT65ul/ml。712100社区,H/O;]2KX
这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少!712100社区6mJZ D}8q
&M-gic*D3~,K0TCA-丙酮沉淀法,有人做过落叶松的的花粉
^+o*b&t$M
w0步骤:
DP6oqyD#|\01、液氮研磨充分
1ERC2Z@
fF02、加入含10%TCA、0.07%的巯基乙醇的丙酮溶液,-20度沉淀过夜
FtnUX(w03、4度,1000rpm离心1个小时,弃上清。
l
T \5{vq04、加100%丙酮,含0.07%的巯基乙醇,沉淀一小时
r7pg"ul#@[8J05、4度,1000rpm离心15分钟,弃上清
*Y$j
uJS%o'ZO1y"q06、重复第4、5步
2Qq$HZ^"T07、80%丙酮,含0.07%的巯基乙醇,沉淀一小时712100社区M,Xx!Fa~9aq+M
8、重复第5步712100社区|9O;{VIN
Ta#?
9、沉淀干燥。
问题:712100社区#HSs]Q
712100社区0r c B$k;D$z?1我最近在提植物的蛋白,做trince sds-page电泳,可是我查阅了相关资料,提取缓冲液有的是用最终浓度为200毫摩每升的tris-cl ,有的是用62。5毫摩每升的tris-cl,我不知道这种浓度究竟会对提蛋白有什么影响,另外,提蛋白质选用tris-cl的ph值又是怎么影响提取效果,也就是提植蛋白时究竟有哪些因素会影响到其效果的。712100社区8v'Q!jD*S^
]h
712100社区6HD\pjc"[
用200毫摩每升的tris-cl 和62.5毫摩每升的tris-cl,我们研究室一般用100毫摩每升的tris-cl,pH 8.0 .另外,最好加150毫摩每升的NaCl,用来分离以弱电荷结合到多糖上的蛋白。
}4ivK]d ]0
5^fH"WtF02我提的蛋白难溶,请问怎么解决?1、请问这是为什么呢?怎么解决?712100社区*U0p-^fMo c'j
2、溶解时是先在100℃沸水浴后在涡旋吗?
a.WW'Qp03、涡旋时产生大量泡沫,对蛋白有影响吗?712100社区x0~;JP xlzj
4、是在常温溶解还是在4℃?或-20℃?
9L,J+c3N1C9?C;d05、一般溶解需要多长时间?怎样才算溶解充分了?
:a/Wk&o\"Hv0我也是做植物叶片的,建议你可以用TCA-丙酮沉淀,方法如下:712100社区u[Ip'V
1、在液氮中研磨叶片30min,加PVP,和石英砂
?1eV,?Dk2S8[02、加入样品体积3倍的提取液(丙酮溶液1)在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃10000rpm以上1小时)弃上清。
FP
M2D Nx#F03. 每份加入9ml丙酮溶液II,捣碎沉淀,常温振动混匀,-20℃沉淀1h;10000rpm,4℃离心15min,弃上清.
{i:l1rv;l u4U04. 每份加入9ml丙酮溶液II,常温振动混匀,-20℃沉淀1h;10000rpm,4℃离心15min,弃上清.712100社区(~+~tbN4U6{
5. 每份加入9ml 80%丙酮溶液III, 常温振动混匀,-20℃沉淀1h, 10000rpm,4℃离心15min,弃上清712100社区t"n-K${7~,eN_
6.干燥成硬块,磨成粉磨-20℃保存待用。712100社区? |oQR#D
第二个问题:
0`[9m_r037度水浴712100社区S|xa$R _"`,p
第三个问题:
