植物组织蛋白质提取方法汇总

7PC"T\0tA dKpa,d0植物组织蛋白质提取方法 （一）
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G%I-U{7R{&pz01、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。712100社区s eS"ZpXI7p.p
2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。712100社区.lR u/aQ ?!]7[
3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
y"}YZ9MX gc!X0蛋白质提取液：300ml712100社区HZ1lc3p'\L
4、提取上清夜，样品制备完成。712100社区/Z3@5}RC!^^[
1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml712100社区B _Y._7FFV
2、甘油（Glycerol）75ml
S1B B0sJ$xvl03、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g
~T)AS,z/h5i7kz0这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！
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植物组织蛋白质提取方法（二）712100社区 QS[UU+|'e
三氯醋酸—丙酮沉淀法712100社区*\j4?j+J5E^Q
1、在液氮中研磨叶片
%j+L}3y#q$Bby:u$L8A02、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。
vm2mE9c03、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。
7Yv/RH0j&oz`04、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。

t0azp?v#k05、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。712100社区 yRqNS0U*@DxP
药品：712100社区]o&f]d~y
提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮
P1oE&@1R2f Q[0裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。712100社区,H/O;]2KX
这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！712100社区6mJZ D}8q

&M-gic*D3~,K0TCA-丙酮沉淀法，有人做过落叶松的的花粉
^+o*b&t$M w0步骤：
DP6oqyD#|\01、液氮研磨充分
1ERC2Z@ fF02、加入含10%TCA、0.07%的巯基乙醇的丙酮溶液，-20度沉淀过夜
FtnUX(w03、4度，1000rpm离心1个小时，弃上清。
l T \5{vq04、加100%丙酮，含0.07%的巯基乙醇，沉淀一小时
r7pg"ul#@[8J05、4度，1000rpm离心15分钟，弃上清
*Y$j uJS%o'ZO1y"q06、重复第4、5步
2Qq$HZ^"T07、80%丙酮，含0.07%的巯基乙醇，沉淀一小时712100社区M,Xx!Fa~9aq+M
8、重复第5步712100社区|9O;{VIN Ta#?
9、沉淀干燥。

问题:712100社区#HSs]Q

1我最近在提植物的蛋白，做trince sds-page电泳，可是我查阅了相关资料，提取缓冲液有的是用最终浓度为200毫摩每升的tris-cl ，有的是用62。5毫摩每升的tris-cl，我不知道这种浓度究竟会对提蛋白有什么影响，另外，提蛋白质选用tris-cl的ph值又是怎么影响提取效果，也就是提植蛋白时究竟有哪些因素会影响到其效果的。712100社区8v'Q!jD*S^ ]h
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用200毫摩每升的tris-cl 和62.5毫摩每升的tris-cl,我们研究室一般用１００毫摩每升的tris-cl，pH 8.0 ．另外，最好加１５０毫摩每升的ＮaCl，用来分离以弱电荷结合到多糖上的蛋白。
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5^fH"WtF02我提的蛋白难溶，请问怎么解决？1、请问这是为什么呢？怎么解决？712100社区*U0p-^fMo c'j
2、溶解时是先在100℃沸水浴后在涡旋吗？
a.WW'Qp03、涡旋时产生大量泡沫，对蛋白有影响吗？712100社区x0~;JP xlzj
4、是在常温溶解还是在4℃？或-20℃？
9L,J+c3N1C9?C;d05、一般溶解需要多长时间？怎样才算溶解充分了？
:a/Wk&o\"Hv0我也是做植物叶片的，建议你可以用TCA-丙酮沉淀，方法如下：712100社区u[Ip'V
1、在液氮中研磨叶片30min，加PVP，和石英砂
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Dk2S8[02、加入样品体积3倍的提取液(丙酮溶液1)在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃10000rpm以上1小时）弃上清。

FP M2D Nx#F03. 每份加入9ml丙酮溶液II，捣碎沉淀，常温振动混匀，-20℃沉淀1h；10000rpm，4℃离心15min，弃上清.
{i:l1rv;lu4U04. 每份加入9ml丙酮溶液II，常温振动混匀，-20℃沉淀1h；10000rpm，4℃离心15min，弃上清.712100社区(~+~tbN4U6{
5. 每份加入9ml 80%丙酮溶液III, 常温振动混匀，-20℃沉淀1h, 10000rpm，4℃离心15min，弃上清712100社区t"n-K${7~,eN_
6．干燥成硬块，磨成粉磨-20℃保存待用。712100社区? |oQR#D
第二个问题：
0`[9m_r037度水浴712100社区S|xa$R _"`,p
第三个问题：
@-U\.e3{#@0涡旋时产生大量泡沫，没有影响
E(cV"Kn0第四个问题：
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r/Tz;G2D037度溶解712100社区pXltz|y6q
第五个问题
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?PVl01个小时，中间混匀数次

出现这种情况是很正常的，要是全部都溶了倒是不太正常。用沉淀法浓缩蛋白都存在一个变性的问题，在具体的操作过程中，有一部分蛋白变性了，所以会不溶解。操作的时候尽量保持低温！
7x7L!~J0} b0溶解的时候可以在常温下，蛋白变成粉末后，立即加1*SDS上样缓冲液，用加样器吹打，大约5分钟就好，可以用来进行下一步的实验了。也可以在4度溶解过夜。
8d$S3V A)qj&BE0涡旋时产生大量泡沫，个人认为影响不大712100社区7Ra-k9L Na,f
一般溶解半个小时就很充分了，但仍会有很多不溶物！可以离心弃掉！ 丙酮沉淀之后要干燥，这个过程一定不要时间太长，不然样品干燥得过了，就很难溶了。即使你加上了硫脲，高浓度尿素也不行。我的经验是只要半个小时左右就足够了，表面上看上去比较干就可以了。
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