(SDS-PAGE)三氯乙酸沉淀法对蛋白质结构影响(转帖学习中）

-a1dQN} LO[6w;_o0SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是蛋白质化学中最常用的研究技术之一，常用于检测蛋白质的纯度和测定蛋白质的分子量.当生物样品的浓度很低或样品中盐浓度>0.1mol・L-1 ，需要对待测样品溶液进行浓缩或除盐.最常用的方法是三氯乙酸（TCA）沉淀法.实验中我们观察到TCA对蛋白质的结构稳定性有较大的影响，它可使蛋白质分子间相互聚集或断裂成碎片，干扰分析结果的准确性.本研究选取了几种蛋白质，使用TCA沉淀，然后在不同时间进行电泳分析和活性测定，探讨TCA对蛋白质结构稳定性的影响.

1 材料和方法
8]6i%MVB8\0    712100社区u|L]G;X&p[
　　1.1 材料 

'?y:?F$F Ig4v0　　三氯乙酸、丙酮均为分析纯试剂，由西安化学试剂厂.丙烯酰胺、双丙烯酰胺、考马斯亮兰G-250、十二烷基硫酸钠（SDS）、牛血清白蛋白（BSA）、胰蛋白酶（Try）、木瓜蛋白酶（Pap），华美生物工程公司.人血清白蛋白（HSA）、尿激酶（UK）、重组人α干扰素（rhIFN-α），由本研究室纯化.Bio-Rad mini-gel电泳仪，Sorvall高速离心机，Shimadzu CS-9000型双波长薄层扫描仪.
m'd_1@9BV6`)S0    
Y)p9{U5fI0　　1.2 方法 712100社区h{5I%aD Z'V4E3G*f

　　分别将BSA，HSA，UK，rhIFN-α，Try，Pap用双蒸水配制成100mg・L-1 的溶液，每一种蛋白质溶液分成6份，每份1mL.将每一份样品同时作以下处理:加入100%TCA0.1mL，混匀，冰浴30分钟;离心，小心弃去上清液;沉淀以丙酮洗涤三次，然后让丙酮挥发干净，放入4℃保存.712100社区I ]d&T#i.s]u*SC"j
   712100社区*H;Q)cU!QV0cX
　　电泳分析方法为:分别于1，3，7，14，21，28d取出1份每1种样品，加入电泳加样缓冲液，煮沸5min，进行SDS-PAGE电泳分析.电泳的分离胶为12.5%，浓缩胶为3%，6×8×0.1cm胶，考马斯亮兰G-250染色，脱色后制成干胶.最后对每1次电泳干胶进行薄层扫描，仪器自动积分给出每条谱带的百分比例，即样品中各成分的百分含量.选择蛋白质的电泳谱带或最大的降解碎片的百分含量对时间作图.蛋白质活性测定中，UK采用气泡上升法测定，rhIFN-α采用VSA病毒攻击Wish细胞法测定.712100社区n2R
[g(G
   712100社区+I.ycm8v\
y
　　2 结果 

　　经TCA沉淀后的UK和rhIFN-α，溶解在磷酸缓冲溶液中，按照气泡上升法测定UK的活性，VSA病毒攻击Wish细胞测定rhIFN-α的生物学活性，两者全部失去生物学活性.说明TCA破坏了UK和rhIFN-α的生物学结构.经TCA沉淀21d后的样品的电泳图谱中可以看出，HSA和BSA均有明显的聚集体和分子断裂碎片形成，高分子量的UK部分降解为低分子量和小分子碎片，Try与Pap较易形成聚集体，rhIFN-α仅有较少量的聚集体出现.
MyG r kb0   712100社区#B6y~bzC2f1e'Q
　　对每次电泳图谱经薄层扫描，计算出单体与主要的小分子碎片的百分含量，并对时间作图（图略），结果蛋白质一部分形成了聚合物，一部分断裂成了碎片.其中HSA与BSA较其它小分子量蛋白质易形成聚集体，而且随时间的延长，各种蛋白质的单体含量逐渐降低，聚集体和碎片分子的含量升高，说明蛋白质的稳定性降低.

　　3 讨论 

　　我们的研究结果表明TCA与蛋白质之间主要有以下几个方面的作用:①在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐.②作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使之聚集沉淀.③随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，TCA可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片，而且随时间的延长这一作用愈加明显.④电泳图谱显示，BSA，HSA单体谱带有较明显的展宽现象，这可能是由于TCA的结合，使SDS与蛋白质的结合量产生偏差，从而造成蛋白质所带电荷的不均一性，造成迁移率的不一致.712100社区*u4eAJkV6iy

    我们认为在电泳时使用TCA对蛋白质样品的浓缩或除盐时，对于分子质量大的蛋白质，要慎重选择TCA.对小分子量蛋白质的浓缩，采用TCA时也有两点需要注意:一是用TCA沉淀后，尽量用丙酮彻底抽提TCA;二是样品处理后要尽快进行电泳分析，以免发生聚集及断裂，造成结果分析的不准确.
h$yZ
o1N0